Gestion de la douleur

Activité De L’acide Fusidique Contre Staphylococcus aureus Extracellulaire Et Intracellulaire: Influence Du pH Et Comparaison Avec Le Linezolid Et La Clindamycine

Contexte L’émergence de Staphylococcus aureus multirésistant a déclenché une réévaluation de l’acide fusidique CEM-, fusidate de sodium Méthodes L’acide fusidique a été examiné pour son activité contre des isolats récents de S aureus résistant à la méthicilline MRSA; modulation de l’activité par pH acide; point de rupture du Comité européen de contrôle de la sensibilité aux antimicrobiens [≤ mg / L] L’activité a été augmentée à des dilutions de pH diminuées pour la concentration inhibitrice minimale dans les cellules de phagocytose et l’activité intracellulaire contre S. aureus sensibles à la méthicilline. parallèlement à une augmentation de l’accumulation bactérienne des médicaments effets opposés pour la clindamycine; Le linézolide reste inchangé L’acide fusidique s’accumule dans les cellules THP environ au niveau du repli, avec une accumulation supplémentaire à pH vs pH L’activité intracellulaire de l’acide fusidique est similaire à celle de la clindamycine et de l’activité relative maximale du linézolide. La vancomycine ou la daptomycine ont été observées. Conclusions L’acide fusidique est actif contre le S aureus en bouillon ainsi que de manière intracellulaire, sans résistance croisée aux autres antibiotiques

Staphylococcus aureus est à la fois un agent pathogène commensal et polyvalent qui provoque diverses infections, notamment lorsqu’une brèche dans la peau ou dans la muqueuse lui permet d’accéder aux tissus sous-jacents ou à la circulation sanguine. en raison d’une capacité remarquable à élargir son génome, et, ainsi, à acquérir des mécanismes de résistance contre des classes entières d’agents antibactériens Ceci a conduit à la résistance aux classes antibiotiques majeures telles que les β-lactamines, les fluoroquinolones et les macrolides. et, plus récemment, d’une réduction progressive de la sensibilité et même de la résistance totale à la vancomycine , à la daptomycine et au linézolide Ces problèmes, combinés à l’émergence d’isolats hautement virulents, ont mis en évidence la nécessité de développer de nouveaux antistaphylococciques. agents Alors que plusieurs nouvelles molécules ont atteint le niveau de développement clinique en phase avancée, elles sont principalement administrées par voie intraveineuse antibio Cela a déclenché des efforts pour réexaminer les médicaments administrés par voie orale plus anciens ayant une activité anti-staphylococcique démontrée et pour examiner comment ceux-ci pourraient fournir au clinicien une approche efficace et raisonnablement sûre face aux isolats multirésistants Dans ce contexte, l’acide fusidique ont montré une faible toxicité et une activité puissante contre les isolats de staphylocoques récents, quelle que soit leur résistance à d’autres classes d’antimicrobiens Bien que largement utilisé en Europe, en Australie, au Canada et en Afrique, S aureus sont restés faibles dans la plupart des pays et sont proches de zéro pour les isolats américains Il a été démontré que le pH acide améliore l’activité de l’acide fusidique contre S aureus Ceci peut être particulièrement important pour le traitement des infections staphylococciques compartiments acides , tels que la peau, le vagin et les voies urinaires, et pour l’éradication des formes intracellulaires de S aureus, qui sont un lso exposée à un pH acide La présente étude examine plus en détail l’influence du pH acide sur l’activité de l’acide fusidique dans les formes extracellulaires et intracellulaires de S aureus, en utilisant une approche développée pour examiner et comparer, en détail, les principales propriétés pharmacologiques et Dans la présente étude, l’acide fusidique a été comparé à la clindamycine et au linézolide, en tant qu’exemples typiques d’antibiotiques dont l’activité est soit altérée soit non modifiée par l’exposition à un pH acide. Dans ces études, nous avons utilisé, une approche pharmacologique dans laquelle les activités de l’acide fusidique et des comparateurs ont été examinées en utilisant des expériences à effet de concentration complet pour obtenir des informations sur les paramètres clés, tels que les efficacités relatives maximales et les puissances relatives, telles que définies dans nos publications précédentes. en détails ci-dessous

MATÉRIAUX ET MÉTHODES

Antibiotiques et réactifs principaux

Linezolid a été obtenu en tant qu’échantillon de laboratoire pour l’évaluation microbiologique de Cempra Pharmaceuticals Linezolid a été obtenu en tant que produit de marque correspondant Zyvoxid distribué en Belgique pour une utilisation clinique par Pfizer SA / NV La clindamycine a été achetée auprès de Sigma-Aldrich ont été achetés auprès d’Invitrogen et d’autres réactifs, y compris le monensin de Sigma-Aldrich ou Merck KGaA

Souches bactériennes, tests de sensibilité et études de concentration-réponse en bouillon

Des études de susceptibilité ont été réalisées avec une collection de souches de Staphylococcus aureus MRSA résistantes à la méthicilline provenant du DP et décrites dans la présente étude et d’isolats américains provenant d’un patient atteint de bactériémie persistante et d’endocardite provenant de PCA et décrits précédemment Concentrations minimales inhibitrices Les CMI ont été déterminées en doublant les dilutions selon les recommandations générales de l’Institut de normalisation clinique et de laboratoire. La catégorisation des isolats pour l’acide fusidique a été évaluée selon les critères cliniques actuels du Comité européen pour les tests de susceptibilité aux antibiotiques EUCAST Les essais pharmacologiques ont été réalisés avec la souche ATCC sensible à la méticilline et la souche MRSA ATCC American Type Culture Collection [ATCC].

Accumulation d’antibiotiques par des bactéries

La souche S aureus ATCC a été cultivée jusqu’à la phase exponentielle moyenne de croissance OD nm =, récoltée par centrifugation rpm, min, et remise en suspension dans un bouillon Mueller Hinton ajusté au pH contenant mg ​​/ L de l’antibiotique à l’étude Après min, les bactéries ont été recueillies par centrifugation rpm, min à ° C, lavé sans lavage antibiotique successives avec une solution saline tamponnée au phosphate glacée [PBS], et lysé par des cycles successifs de congélation-décongélation min à – ° C, suivis de min à ° C. antibiotique a été mesurée par le disque-plaque en utilisant Antibiotic Medium BD et S aureus ATCC comme les valeurs typiques d’organisme d’essai obtenues pour les antibiotiques, CEM-: limite inférieure de détection, – mg / L, réponse linéaire entre et mg / L [R =]; linézolide: limite inférieure de détection, mg / L, réponse linéaire entre – et mg / L [R =]; clindamycine: limite inférieure de détection, mg / L, réponse linéaire entre et mg / L [R =], et exprimée par référence à la teneur totale en protéines bactériennes de l’échantillon

Lignes cellulaires et évaluation de la viabilité cellulaire, et accumulation cellulaire d’antibiotiques

Des expériences ont été menées avec des cellules THP humaines ATCC TIB-, une lignée cellulaire myélomonocytaire présentant une activité similaire aux macrophages et maintenue dans notre laboratoire comme décrit précédemment La viabilité des cellules exposées aux différentes conditions utilisées dans la présente étude antibiotiques, pH a été vérifiée par une épreuve d’exclusion au bleu Trypan Aucune différence significative n’a été notée entre les cellules traitées et les cellules témoins.% de cellules colorées L’accumulation cellulaire d’antibiotiques a été mesurée avec des cellules non infectées, car l’absence de médicament radiomarqué nécessitait de grandes concentrations extracellulaires d’antibiotiques ≥ mg / L détection satisfaisante du médicament intracellulaire correspondant, qui empêchait la croissance bactérienne intracellulaire voir résultats Les cellules ont été incubées avec l’antibiotique à l’étude pendant le temps désiré avec ou sans inhibiteurs, recueillies par un pastillage doux; Pour les études de dépendance au pH, les cellules ont été incubées avec des milieux tamponnés ajustés à des valeurs de pH spécifiques allant du pH exact de chaque milieu à une mesure avant et après l’incubation, et ont été trouvé ne pas varier de plus d’une unité de pH pendant l’expérience Les culots cellulaires ont été remis en suspension dans de l’eau distillée; les lysats résultants ont été utilisés pour déterminer la teneur en antibiotiques et utilisés dans un test protéique en utilisant une technique générale décrite précédemment Le contenu cellulaire de l’antibiotique a été exprimé en référence à la teneur totale en protéines cellulaires et converti en concentrations cellulaires totales apparentes en utilisant un facteur de conversion / mg de protéine cellulaire

Détermination de l’activité intracellulaire des antibiotiques

Les activités intracellulaires ont été mesurées contre des bactéries phagocytées par les THP-macrophages suivant la procédure générale décrite dans nos publications antérieures En bref, les bactéries ont été opsonisées avec du sérum humain non décongestionné fraîchement décongelé dilué: dans du milieu de culture sans sérum RPMI; Invitrogen La phagocytose a été réalisée à un rapport: bactéries-macrophages L’élimination des bactéries non phagocytées et la collecte des cellules à la fin de l’expérience ont été réalisées par centrifugation à température ambiante rpm; min Les cellules ont ensuite été exposées à des antibiotiques en utilisant, pour des expériences dépendant de la concentration, une large gamme de concentrations, allant généralement de fois à la CMI en bouillon à la fin des expériences, les cellules ont été recueillies par centrifugation, remises en suspension dans du PBS, centrifugées. encore une fois pour éliminer davantage les bactéries adhérentes, puis lysées dans de l’eau distillée et traitées pour le comptage CFU unité coliformes en plaquant sur agar des études antérieures ont montré que les quantités d’antibiotiques qui pourraient être transférés des cellules dans le test final étaient trop faibles pour interférant significativement avec les déterminations de CFU, étant donné la forte dilution de la teneur en cellules pendant la préparation de l’échantillon. Les protéines cellulaires ont été mesurées en parallèle, et les résultats exprimés en CFU / mg de protéine.

Solubilité et stabilité chimique de l’acide fusidique

La solubilité et la stabilité chimique de l’acide fusidique dans les diverses conditions utilisées dans la présente étude ont été évaluées par inspection visuelle et par chromatographie liquide haute pression, cette dernière utilisant un Waters Alliance System, Waters Corp, équipé d’un dispositif de détection à barrette de diodes; conditions de chromatographie: Lichrosphère RP- colonne [× mm, μM; Merck AG]; élution: acétonitrile / tampon phosphate mM pH [v / v,:]; temps de rétention typique: min

Ajustement de courbe et analyses statistiques

GraphPad Pour les expériences examinant le changement de CFU en fonction des expériences dépendantes de la concentration de l’antibiotique, les données ont été utilisées pour calculer les descripteurs pharmacologiques pertinents de la réponse biologique, tels que dérivés des paramètres de régression de la l’équation de Hill correspondante sigmoïde; facteur de pente =, à savoir les efficacités minimales et maximales relatives Emin et Emax, les deux en unités logarithmiques, les puissances relatives et les concentrations statiques EC et Cs, toutes deux en mg / L [concentrations en poids; nous permettant de relier la valeur aux concentrations réelles observées dans le sérum ou d’autres compartiments] ou multiples de la CMI [nous permettant de comparer différents antibiotiques ayant des CMI distincts pour l’antibiotique analysé ou différentes souches contre lesquelles un antibiotique donné a des CMI distincts]. l’analyse a été décrite en détails dans nos publications précédentes avec divers antibiotiques et / ou conditions d’essai [-,,] En bref, Emin est le changement de CFU habituellement positif pour une concentration infiniment faible d’antibiotique par rapport à l’inoculum original et décrit la croissance de la bactérie en l’absence d’antibiotique; Emax est le changement de CFU habituellement négatif pour une concentration infiniment grande d’antibiotique par rapport à l’inoculum original et décrit l’effet maximal obtenu avec l’antibiotique quand, vraisemblablement, tous ses sites de liaison au niveau des cibles bactériennes ont été saturés; EC correspond à la concentration en médicament entraînant une modification de la réduction de CFU à mi-chemin entre Emin et Emax ce paramètre, commun dans les évaluations pharmacologiques des médicaments, aborde essentiellement les différences d’affinités apparentes du médicament pour sa cible [s]; Cs correspond à la concentration du médicament ne causant aucun changement apparent par rapport à l’inoculum d’origine et est similaire et sa valeur souvent proche d’un MIC conventionnel. Des analyses statistiques ont été faites avec le logiciel GraphPad Instat, version

RÉSULTATS

Solubilité et stabilité chimique de l’acide fusidique

Aucune preuve visible de dissolution incomplète n’a été observée dans le bouillon acide pH lorsque les concentrations en acide fusidique dépassaient mg ​​/ L. Aucune instabilité chimique & aucun% de récupération du médicament intact n’a été observé dans les conditions expérimentales utilisées ici, sans influence significative du pH et aucune apparence des profils d’élution anormaux qui auraient annoncé l’apparition de produits de dégradation

Répartition MIC de l’acide fusidique pour les isolats récents de SARM

Dans la première série d’expériences, nous avons examiné la sensibilité d’une collection récente d’isolats de SARM d’hôpital N = à l’acide fusidique, provenant de patients présentant des infections de la peau et de la peau, bactériémie et endocardite. type d’infection, environ% des souches étaient sensibles selon les seuils cliniques EUCAST pour l’acide fusidique S ≤ mg / L, avec seulement une souche présentant un niveau de résistance élevé mg / L Les CMI de l’acide fusidique contre la souche ATCC et le SARM ATCC était une dilution mg / L supérieure à la valeur CMI modale des isolats cliniques de SARM, démontrant en outre que l’acide fusidique n’était pas affecté par le phénotype de résistance aux méthicillines des souches cliniques. La souche ATCC MSSA a été utilisée pour la plupart des expériences subséquentes. SARM ATCC dans notre évaluation de l’activité intracellulaire décrite ci-dessous

Figure View largeTélécharger la diapositive Concentration inhibitrice minimale Distribution MIC de l’acide fusidique CEM- contre un panel d’isolats de S aureus résistants à la méthicilline provenant de patients souffrant d’infections de la peau et de la peau, bactériémie et endocardite La ligne verticale en pointillés sépare les isolats considérés sensibles et résistants selon points de rupture clinique du Comité européen sur les tests de sensibilité aux antimicrobiens Figure Vue largeTélécharger diapositive Concentration inhibitrice maximale Distribution MIC de l’acide fusidique CEM- contre un panel d’isolats de S aureus résistants à la méthicilline chez des patients souffrant d’infections cutanées et cutanées, de bactériémie et d’endocardite La ligne pointillée verticale sépare les isolats considérés sensibles et résistants selon les points de rupture cliniques du Comité européen sur les tests de sensibilité aux antimicrobiens

Influence du pH sur la concentration intrabactérienne et la CMI des antibiotiques

Dans une seconde série d’expériences, nous avons examiné l’effet du pH sur l’accumulation d’acide fusidique par S aureus et sur la CMI correspondante en utilisant la souche ATCC Clindamycine et le linézolide comme comparateurs. La Figure A montre que l’accumulation d’acide fusidique était améliorée lorsque le pH a été diminué de à, contrairement à la clindamycine, pour laquelle un comportement opposé a été observé diminution marquée au pH acide, et à linézolide pas significatif, effet cohérent Ces changements d’accumulation étaient compatibles avec les changements de CMI sur la même gamme de pH Ainsi, l’acide fusidique avait une CMI considérablement plus faible à pH acide qu’à pH neutre avec une valeur aussi faible que mg / L à pH. En revanche, la clindamycine a montré une augmentation de la CMI jusqu’à mg / L à pH et la CMI du linézolide mg / L inchangé dans toute la gamme des valeurs de pH étudiées

Figure View largeDownload slideInfluence du pH sur l’accumulation intrabactérienne A et concentration inhibitrice minimale MIC B de l’acide fusidique CEM-, clindamycine et linézolide contre la souche Staphylococcus aureus ATCC A: bactéries en croissance ont été incubées min dans un bouillon ajusté au pH avec antibiotique mg / L Les résultats sont exprimés comme les valeurs de la drogue intrabactérienne sont les moyennes ± SD des déterminations indépendantes B: MICs mesurés dans le bouillon Mueller Hinton ajusté au pH Les valeurs sont des moyennes d’échantillons indépendants donnant des valeurs identiques Analyse statistique – analyse de la variance [ANOVA] avec le multiple de Dunnett des comparaisons post-test pour examiner la variation de la réponse en fonction du changement de pH: accumulation d’acide fusidique et CMI, P & lt; ; accumulation de clindamycine et MIC, P & lt; ; Fluctuations du pH sur l’accumulation intrabacérienne A et concentration minimale inhibitrice MIC B de l’acide fusidique CEM-, clindamycine et linézolide contre la souche Staphylococcus aureus ATCC A: les bactéries en croissance ont été incubées pendant min à pH ajusté bouillon avec antibiotique mg / L Les résultats sont exprimés comme les valeurs de contenu intrabacial des médicaments sont des moyennes ± écart-type de déterminations indépendantes B: MICs mesurés dans le bouillon Mueller Hinton ajusté au pH Valeurs sont des moyennes d’échantillons indépendants donnant des valeurs identiques Analyse statistique-analyse de la variance [ANOVA] avec les comparaisons multiples de Dunnett posttest pour examiner la variation de la réponse en fonction du changement de pH: l’accumulation d’acide fusidique et MIC, P & lt; ; accumulation de clindamycine et MIC, P & lt; ; accumulation de linézolide et CMI, non significatif

Influence du pH sur l’activité dose-réponse des antibiotiques dans le bouillon

Pour mieux caractériser l’influence du pH sur l’activité de l’acide fusidique par rapport à la clindamycine et au linézolide, nous avons réalisé des études détaillées de la concentration et de la dépendance dans des bouillons ajustés aux valeurs de pH. paramètres de régression présentés dans le tableau

Paramètres de régression de table, descripteurs pharmacologiques et analyses statistiques des courbes de concentration-réponse illustrées en Figure Bouillon et Figure Staphylococcus aureus ATCC Bouillon antibiotique pH Bouillon pH THP- cellules Emaxa ECb Csc R Emaxa ECb Csc R Emaxa ECb Csc R Acide sulfurique CEM- – – à – a, c; A mg / L – c; A – – en a, c, A mg / L – b, B – – en – a, c, B mg / L – a, A × MIC – b; A × MIC – b; A × CMI – a; A Clindamycine – – à – A; A mg / L – a; A – – à – a; A mg / L – a; B – – à – a: B mg / L – b; A × CMI – a; A × CMI – a; A × CMI – b; A Linézolide – – à – b, c; A mg / L – b; A – – à – b ; cA mg / L – a; A – – à – b, c; B mg / L – a; B × CMI – a; A × CMI – a; A × CMI – b; B bouillon antibiotique Bouillon pH pH THP- Cellules Emaxa ECb Csc R Emaxa ECb Csc R Emaxa ECb Csc R Acide sulfurique CEM- – – à – a, c; A mg / L – c; A – – à a, c; A mg / L – b; B – – à – a, c ; B mg / L – a; A × CMI – b; A × CMI – b; A × CMI – a; A Clindamycine – – à – A; A mg / L – a; A – – à -a; A mg / L – a; B – – à – a B mg / L – b; A × CMI – a; A × CMI – a; A × CMI – b; A Linézolide – – à – b, c; A mg / L – b; A – – à – b; cA mg / L – a; A – – à – b, c; B mg / L – a; B × CMI – a; A × CMI – a; A × CMI – b; B NOTE CFU, unité formant une colonie; CMI, concentration minimale inhibitrice Les analyses statistiques ont été effectuées comme suit: analyse par colonne de l’analyse de la variance avec le test de Tukey pour des comparaisons multiples entre chaque paramètre de tous les médicaments: les données avec différentes lettres minuscules sont significativement différentes les unes des autres. ; analyse par analyse de variance en ligne avec le posttest de Tukey pour des comparaisons multiples entre le pH du bouillon, le pH du bouillon et les cellules THP: les données avec différentes lettres majuscules sont significativement différentes les unes des autres P & lt; a Efficacité relative maximale: Diminution des unités logarithmiques à h du bouillon initial correspondant ou postphagocytose des cellules THP inoculum, extrapolées pour une concentration antibiotique infiniment grande obtenue à partir du facteur de pente de l’équation de Hill = bRelative de l’activité: concentration en mg / L ou en multiples de MIC; bouillon: tel que déterminé au pH correspondant; Cellules THP: comme déterminé en bouillon à pH provoquant une réduction de l’inoculum à mi-chemin entre l’augmentation Emin de CFU pour une concentration antibiotique infiniment faible et Emax, obtenue à partir de l’équation de Hill concentration en mg / L ou en multiples de MIC; bouillon: tel que déterminé au pH correspondant; Cellules THP: telles que déterminées en bouillon à pH pour lequel aucune croissance bactérienne apparente n’a été détectée pas de changement par rapport à l’inoculum initial, comme déterminé par interpolation graphique

Figure Vue largeDownload slideConcentration de l’activité de l’acide fusidique CEM-, clindamycine et linézolide contre la souche ATCC de Staphylococcus aureus dans un bouillon Mueller Hinton ajusté au pH Les bactéries initiales inoclum, unité formant des colonies [UFC] / mL ont été incubées pendant h à des concentrations croissantes des antibiotiques médicament total; panneaux supérieurs, concentrations en poids; Les ordonnées montrent le changement du nombre d’échelle logarithmique de CFU par millilitre de bouillon. Toutes les valeurs sont des moyennes ± écart-type des déterminations indépendantes lorsqu’elles ne sont pas visibles, les barres SD sont plus petites. que la taille des symboles Les données ont été utilisées pour adapter une fonction sigmoïde Hill; Facteur de pente = pour chaque antibiotique Les flèches horizontales verte et rouge montrent le déplacement des concentrations statiques Cs observées respectivement pour l’acide fusidique CEM- et la clindamycine lors du changement du pH du pH. Voir Tableau pour les valeurs numériques et les analyses statistiques. activité de l’acide fusidique CEM-, clindamycine et linézolide contre la souche ATCC de Staphylococcus aureus dans un bouillon Mueller Hinton ajusté au pH Des bactéries initiales inoclum, unité formant une colonie [UFC] / mL ont été incubées pour h avec des concentrations croissantes de médicament antibiotique total; panneaux supérieurs, concentrations en poids; Les ordonnées montrent le changement du nombre d’échelle logarithmique de CFU par millilitre de bouillon. Toutes les valeurs sont des moyennes ± écart-type des déterminations indépendantes lorsqu’elles ne sont pas visibles, les barres SD sont plus petites. que la taille des symboles Les données ont été utilisées pour adapter une fonction sigmoïde Hill; Facteur de pente = pour chaque antibiotique Les flèches horizontales verte et rouge montrent le déplacement des concentrations statiques Cs observées respectivement pour l’acide fusidique CEM- et la clindamycine lors du changement du pH. Voir Tableau pour les valeurs numériques et les analyses statistiquesLes concentrations statiques Cs de l’acide fusidique et la clindamycine, exprimée en mg / L, a été nettement diminuée et augmentée, respectivement, lorsque le pH du bouillon a été déplacé de à Inversement, aucun ou seulement des changements minimes ont été observés dans les paramètres Emin non représentés et Emax, indiquant que, bien que le changement Ce changement de puissance, observé dans ces expériences, était directement proportionnel au changement de CMI vu dans la Figure, comme toutes les courbes et les valeurs Cs correspondantes. deviennent presque indiscernables lorsque les mêmes données sont présentées en fonction des multiples de CMI mesurés au pH correspondant

Accumulation cellulaire d’antibiotiques et influence du pH et du collapseur de gradient de pH lysosomial / cytoplasmique de monensine

Dans les séries d’expériences suivantes, nous avons examiné dans quelle mesure l’acide fusidique s’accumule dans les THP-macrophages par rapport aux autres antibiotiques, et si cette accumulation serait modifiée par la monensine, un effondreur connu du gradient de pH lysosomal-cytoplasmique que l’acide fusidique et la clindamycine s’accumulaient dans les cellules THP atteignant un rapport de concentration apparent cellulaire à extracellulaire d’environ, tandis que la concentration intracellulaire de linézolide était seulement deux fois plus élevée que sa concentration extracellulaire. La diminution du pH du milieu d’incubation entraînait une augmentation marquée du facteur fusidique. accumulation d’acide, tandis que l’effet opposé a été observé à la fois pour la clindamycine et le linézolide. Figure B L’addition de monensin a réduit considérablement l’accumulation de clindamycine et de linézolide, alors qu’elle n’a augmenté que légèrement l’accumulation d’acide fusidique

Figure Vue largeDownload slideCellular accumulation d’antibiotiques dans les THP-macrophages et influence du pH et de la monensine Tous les antibiotiques ont été testés à une concentration extracellulaire de mg / L pour permettre une détection quantitative satisfaisante des concentrations intracellulaires d’antibiotiques. non visibles, les barres SD sont plus petites que la taille des symboles A: rapport de concentration cellulaire à extracellulaire après h incubation Analyse statistique – analyse de la variance [ANOVA] avec les comparaisons multiples Tukey-Kramer posttest: les barres avec des lettres différentes sont significativement différentes autre P & lt; Analyse statistique: l’analyse ANOVA avec les comparaisons multiples de Dunnett posttest pour examiner la variation de la réponse en fonction du changement de pH: tous les antibiotiques montrent des changements significatifs de l’accumulation lors du changement de pH dans l’eau. la gamme étudiée P & lt; C: Influence de la présence de μM de monensin sur l’accumulation cellulaire d’antibiotiques h incubation Analyse statistique – ANOVA avec les comparaisons multiples de Dunnett posttest: les barres de lettres différentes sont significativement différentes les unes des autres P & lt; Figure Vue largeDownload slideCellular accumulation d’antibiotiques dans les THP-macrophages et influence du pH et de la monensine Tous les antibiotiques ont été testés à une concentration extracellulaire de mg / L pour permettre une détection quantitative satisfaisante des concentrations intracellulaires d’antibiotiques. non visibles, les barres SD sont plus petites que la taille des symboles A: rapport de concentration cellulaire à extracellulaire après h incubation Analyse statistique – analyse de la variance [ANOVA] avec les comparaisons multiples Tukey-Kramer posttest: les barres avec des lettres différentes sont significativement différentes autre P & lt; Analyse statistique: l’analyse ANOVA avec les comparaisons multiples de Dunnett posttest pour examiner la variation de la réponse en fonction du changement de pH: tous les antibiotiques montrent des changements significatifs de l’accumulation lors du changement de pH dans l’eau cortical. la gamme étudiée P & lt; C: Influence de la présence de μM de monensin sur l’accumulation cellulaire d’antibiotiques h incubation Analyse statistique – ANOVA avec les comparaisons multiples de Dunnett posttest: les barres de lettres différentes sont significativement différentes les unes des autres P & lt;

Activité intracellulaire des antibiotiques

Dans ces expériences, nous avons d’abord mesuré les activités de l’acide fusidique, de la clindamycine et du linézolide contre les S aureus phagocytés ATCC en réalisant des expériences dépendant de la concentration. Figure Tous les antibiotiques ont montré des efficacités relatives maximales similaires Emax à près de logarithmie des CFU diminuent par rapport à la postphagocytose inoculum Lorsque l’on considère les puissances relatives EC, aucune différence significative n’a été observée entre les réponses dans le bouillon et les cellules THP pour l’acide fusidique et la clindamycine, mais une valeur plus faible a été observée pour le linézolide. croissance intracellulaire observée en examinant la concentration statique intracellulaire Cs, on voit que ceux-ci sont ~, ~, et ~ × la CMI correspondante dans le bouillon à pH pour l’acide fusidique, la clindamycine et le linézolide, respectivement

Figure Vue largeDownload slideConcentration de l’activité de l’acide fusidique CEM-, clindamycine et linézolide contre Staphylococcus aureus ATCC phagocytisé par les THP-macrophages Après la phagocytose et l’élimination des bactéries non phagocytées initial inoclum: ~ unité formant des colonies [CFU] / mg de cellule protéine, les cellules ont été incubées pour h avec des concentrations croissantes de médicament total antibiotiques; panneau A, concentrations en poids; panneau B, multiple de la concentration minimale inhibitrice [MIC] mesurée en bouillon à pH Les ordonnées montrent la variation du nombre d’échelle logarithmique CFU par milligramme de protéine cellulaire. Toutes les valeurs sont moyennes ± écart-type de déterminations indépendantes lorsqu’elles ne sont pas visibles. les barres sont plus petites que la taille des symboles Les données ont été utilisées pour ajuster une fonction sigmoïde de Hill; Facteur de pente = pour chaque antibiotique Voir Tableau des valeurs numériques des paramètres correspondants et des analyses statistiquesFigure Vue largeDownload slideConcentration de l’activité de l’acide fusidique CEM-, clindamycine et linézolide contre Staphylococcus aureus ATCC phagocytisé par les THP-macrophages Après phagocytose et ablation de bactérie non phagocytaire initiale inoclum: ~ unité formant une colonie [CFU] / mg de protéine cellulaire, les cellules ont été incubées pour h avec des concentrations croissantes de médicament total antibiotiques; panneau A, concentrations en poids; panneau B, multiple de la concentration minimale inhibitrice [MIC] mesurée en bouillon à pH Les ordonnées montrent la variation du nombre d’échelle logarithmique CFU par milligramme de protéine cellulaire. Toutes les valeurs sont moyennes ± écart-type de déterminations indépendantes lorsqu’elles ne sont pas visibles. les barres sont plus petites que la taille des symboles Les données ont été utilisées pour ajuster une fonction sigmoïde de Hill; Voir le tableau pour les valeurs numériques des paramètres correspondants et les analyses statistiques. Nous avons ensuite fait une comparaison directe entre les souches ATCC MSSA et MRSA ATCC pour la sensibilité à l’acide fusidique après phagocytose par les cellules THP, en utilisant le même protocole que pour la comparaison entre antibiotiques Les résultats sont présentés sur la figure et montrent que les souches ne peuvent être distinguées les unes des autres quel que soit le paramètre pharmacologique examiné Emax, E ou Cs, démontrant une équivalence dans la réponse

Figure View largeTélécharger la réponse de concentration de l’activité de l’acide fusidique CEM-, contre la souche ATCC de Staphylococcus aureus sensible à la méthicilline et ATCC résistant à la méthicilline MRSA ATCC phagocytée par la concentration minimale inhibitrice [CMI] des THP-macrophages en pH et pH: mg / L et mg / L pour les deux souches Après phagocytose et élimination des bactéries non phagocytées inoclum initial: ~ unité formant une colonie [CFU] / mg de protéine cellulaire, les cellules ont été incubées pour h avec des concentrations croissantes d’antibiotiques mg / L; total des médicaments Les ordonnées montrent la variation du nombre d’UFC par milligramme de protéine cellulaire. Toutes les valeurs sont des moyennes ± ET de déterminations indépendantes lorsqu’elles ne sont pas visibles, les barres SD sont plus petites que la taille des symboles. sigmoïde; facteur de pente = pour chaque contrainte Il n’y a pas de différences significatives entre les fonctions prises globalement ou entre leurs principaux paramètres Emin, Emax et EC; Le Cs est similaire mg / L et mg / L, respectivement. Voir la réponseConcentration de l’activité de l’acide fusidique CEM-, contre Staphylococcus aureus sensible à la méthicine souche ATCC et résistant à la méthicilline S aureus SARM ATCC phagocyté par THP-macrophages inhibiteur minimum Concentration [CMI] en bouillon à pH et pH: mg / L et mg / L pour les deux souches Après phagocytose et élimination des bactéries non phagocytées inoclum initial: ~ unité formant une colonie [CFU] / mg de protéine cellulaire, cellules incubées h avec des concentrations croissantes d’antibiotiques mg / L; total des médicaments Les ordonnées montrent la variation du nombre d’UFC par milligramme de protéine cellulaire. Toutes les valeurs sont des moyennes ± ET de déterminations indépendantes lorsqu’elles ne sont pas visibles, les barres SD sont plus petites que la taille des symboles. sigmoïde; facteur de pente = pour chaque contrainte Il n’y a pas de différences significatives entre les fonctions prises globalement ou entre leurs principaux paramètres Emin, Emax et EC; le Cs est similaire mg / L et mg / L, respectivement

Figure Vue largeDownload slideL’activité intracellulaire des antibiotiques testés après incubation de cellules THP à une concentration extracellulaire correspondant au total de la Cmax humaine; acide fusidique [CEM-], mg / L; linézolide, mg / L; vancomycine, mg / L; daptomycine, en mg / L, contre la souche de Staphylococcus aureus ATCC, HMC et HMC concentrations inhibitrices minimales [CMI]: acide fusidique [CEM-],,, et mg / L; linézolide, mg / L pour toutes les souches; vancomycine,, et mg / L; daptomycine, et mg / L Les ordonnées montrent la variation du nombre d’échelle logarithmique CFU par milligramme de protéine cellulaire. Toutes les valeurs sont moyennes ± écart-type de déterminations indépendantes lorsqu’elles ne sont pas visibles, les barres SD sont plus petites que la taille des symboles. Activité intracellulaire des antibiotiques testés après h incubation des cellules THP à une concentration extracellulaire correspondant au médicament total Cmax humain; acide fusidique [CEM-], mg / L; linézolide, mg / L; vancomycine, mg / L; daptomycine, en mg / L, contre la souche de Staphylococcus aureus ATCC, HMC et HMC concentrations inhibitrices minimales [CMI]: acide fusidique [CEM-],,, et mg / L; linézolide, mg / L pour toutes les souches; vancomycine,, et mg / L; daptomycine, et mg / L Les ordonnées montrent la variation du nombre d’échelle logarithmique CFU par milligramme de protéine cellulaire. Toutes les valeurs sont des moyennes ± écart-type de déterminations indépendantes lorsqu’elles ne sont pas visibles, les barres SD sont plus petites que la taille des symboles. isolats cliniques obtenus d’un patient présentant une bactériémie staphylococcique persistante HMC, valve aortique; HMC, isolat sanguin [résistant à la vancomycine et à la daptomycine] et comparant l’activité intracellulaire de l’acide fusidique à celle de la vancomycine, du linézolide et de la daptomycine, en utilisant une concentration extracellulaire fixe d’antibiotique correspondant à la Cmax humaine rapportée par chaque antibiotique. , l’activité intracellulaire de l’acide fusidique était très similaire à celle de la souche ATCC, et similaire à celle de la vancomycine et du linézolide. L’activité intracellulaire de la daptomycine était plus grande pour la souche de laboratoire ATCC mais similaire ou inférieure à celle de acide fusidique pour les isolats HMC et HMC

DISCUSSION

cumul d’acide organique faible et de bases organiques faibles dans les compartiments membranaires où un gradient de pH est maintenu avec le milieu environnant Un phénomène inverse est attendu pour la clindamycine, une base organique faible avec pKa ~ , et c’est ce que nous avons observé Ces résultats suggèrent que l’acide fusidique pourrait présenter un avantage potentiel sur la clindamycine et le linézolide lorsqu’il est utilisé contre les staphylocoques dans les compartiments acides . tels que le pH de la peau, le pH de la bouche, le pH du vagin ou le pH du tractus urinaire, sans différence attendue entre SASM et SARM, à condition qu’ils présentent les mêmes CMI dans les études de sensibilité. être confirmé dans des modèles animaux appropriés ou des études cliniquesAccumulation de l’acide fusidique dans les cellules eucaryotes a été décrite il y a des années en utilisant des leucocytes polynucléaires et des lymphocytes, avec des valeurs plus ou moins similaires t Ce qui a été observé dans cette étude Les premières études ont également montré que l’acide fusidique n’altère pas le métabolisme oxydatif des monocytes , ce qui suggère que son accumulation ne nuit pas aux défenses de l’hôte. Des études précoces avec des adultes en bonne santé, est faible ~ L / kg Ainsi, il est possible que l’accumulation cellulaire de l’acide fusidique soit restreinte aux cellules phagocytaires Ceci devrait être étudié dans le futur Le mécanisme de cette accumulation, ainsi que la distribution subcellulaire Cependant, les données disponibles suggèrent déjà que l’accumulation cellulaire de l’acide fusidique doit reposer sur des mécanismes très différents de ceux de la clindamycine et du linézolide. En effet, on observe des effets divergents avec une incubation à pH acide et avec des co- incubation avec le monensin Le comportement de la clindamycine et du linézolide est compatible avec un piégeage partiel des lysosomes et des acides intracellulaires Vacuoles [,,,] En tant qu’acide organique faible, l’acide fusidique devrait s’accumuler dans les compartiments membranaires membranaires des cellules eucaryotes, tels que les mitochondries avec un pH de repos autour de Ceci devra être étudié expérimentalement, mais nécessite la disponibilité du composé marquéAccumulation de l’acide fusidique dans les cellules THP n’a pas été associée à une plus grande activité que dans le bouillon, en dépit de l’accumulation cellulaire démontrée du médicament et sa puissance accrue prévue à un pH acide Au contraire, nous avons vu une réduction On a observé une réduction de la puissance du médicament mesurée par son Cs et son Emax Réduction de l’efficacité relative maximale des formes intracellulaires de S aureus pour la plupart des antibiotiques étudiés jusqu’ici [,,,] Dans la situation actuelle, tous les antibiotiques étudiés est plus liée à une résistance intrinsèque des bactéries intracellulaires qu’à une propriété spécifique de chacun de ces médicaments Nous connaissons d’autres molécules pour lesquelles la Comme décrit dans cette étude, l’activité plus faible que prévu de l’acide fusidique contre les bactéries intraphagocytaires ne peut pas être liée à l’instabilité ou la dégradation Une explication possible pourrait être que la localisation subcellulaire de l’acide fusidique dans les mitochondries le rend partiellement indisponible pour l’activité contre les formes intracellulaires de S aureus qui prospèrent dans les phagolysosomes Alternativement, il est possible que S aureus arrête transitoirement les fonctions métaboliques ciblées par l’acide fusidique une fois qu’il atteint le milieu intracellulaire, Parallèlement à sa replication bactérienne intracellulaire réduite, on peut cependant affirmer que l’activité intracellulaire de l’acide fusidique n’est pas globalement différente de celle de la clindamycine, de la daptomycine ou du linézolide et ne semble pas affectée par les mécanismes de résistance spécifiques. à ces antibiotiques ou par résistance à la méthicillineMarie-Claire C Ambier et Charlotte Misson ont fourni une assistance technique dédiée tout au long de ce travail. SL est chercheur postdoctoral et FVB est un chercheur senior du Fonds de la Recherche Scientifique belge FRS-FNRSSupplement parrainage Cet article a été publié dans le cadre d’un supplément intitulé « Fusidic Acid Enters the Etats-Unis « sponsorisé par » Cempra Pharmaceuticals « Conflits d’intérêts potentiels: SL, FVB et PMT, à travers l’Université catholique de Louvain, a reçu des subventions de recherche de Cempra Pharmaceuticals, Rib-X Pharmaceuticals, Trius Pharmaceuticals, et la Medicines Company FVB a reçu Les honoraires de consultation de la compagnie de médecines et de Trius Pharmaceuticals PMT a reçu des honoraires de consultation par son établissement d’Astellas, Wockaert, et Bayer, et a reçu le paiement pour des conférences par son établissement pour des conférences / bureaux de conférenciers et développement de présentations éducatives de GlaxoSmithKline DP et PCA pas de conflits d’intérêts t lié à ce travail

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